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BioRadPCR仪；伯乐PCR仪反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：

①引物长度：-bp，常用为bp左右。

②引物扩增跨度： 以-bp为宜，特定条件下可扩增长至kb的片段。

③引物碱基：G C含量以-%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物’端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

Bio-Rad-pcr仪 - 工作原理；

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至℃左右一定时  聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

 每完成一个循环需～分钟，～小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

Bio-Rad-荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

现将其原理简述如下：

荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的&#;－&#;外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

发布时间：2022-12-15 22:57